صحه گذاری روش های آزمون کمی در آزمایشگاه (Method Validation)

به نام خدا

از سری نوشته­­ های “برای آزمایشگاهیان نوشته­ ام” ۱۱

۱۴۰۰/۱۰/۱۱

بازنگری شده در تاریخ ۱۴۰۲/۰۴/۰۹

حقوق مادی و معنوی این نوشتار برای نویسنده محفوظ است.

 

صحه گذاری روش های کمی در آزمایشگاه

(Method Validation)؛

گام های در حد تصدیق کیت های آزمایشگاهی

(Method Verification)

برای انجام آزمون های کمّی در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی

 

 

Method validation

 Method verification steps for quantitative methods by IVD kits

 

نویسنده: دکتر صغری روحی دهنبه

منبع تصاویر: اینترنت یا ترسیم شده توسط نویسنده

 

به قول شاعر

 نامی از خویش در جهان بگذار         زندگانی برای مردن نیست

                                                                                                                    ناظم هروی  

 

مقدمه 

در مقاله

صحه گذاری روش های آزمون کمی در آزمایشگاه

(Method Validation)؛

گام های در حد تصدیق کیت های آزمایشگاهی

(Method Verification)

برای انجام آزمون های کمّی در آزمایشگاه های تشخیص پزشکی

نویسنده به معرفی گام های متوالی و متعامل

 برای تصدیق کیت­ های آزمایشگاهی برای انجام آزمون­ های کمّی

 بر اساس بند ۵-۵-۱-۲ استاندارد INSO-ISO 15189

پرداخته است.    

 

سخن نویسنده

با توجه به اهمیت گام ۲۲ از

چهل گام تا استقرار سیستم مدیریت کیفیت بر اساس استاندارد ۱۵۱۸۹

و قول داده شده در انتهای مقاله فوق 

 ” برای آزمایشگاهیان نوشته ­ام ۱۰ “،

اکنون در مقاله ” برای آزمایشگاهیان نوشته­ ام ۱۱ ” به موضوع

“

صحه گذاری روش های آزمون کمی در آزمایشگاه

(Method Validation) در حد تصدیق؛

 ”

پرداخته ام.

مطالعه این مطلب کاربردی به مدیران کیفیت و مسئولین کنترل کیفی آزمایشگاه­های پزشکی

توصیه می ­شود

تا با کمک این مطالب که با گویش ساده بیان شده است آن قدر توانمند شوید تا

روش اجرایی و دستورالعمل  مربوطه را در آزمایشگاهتان بنویسید و

 سپس با مشارکت همکاران آزمایشگاه، آن را در آزمایشگاه اجرا نمایید.

با آرزوی موفقیت برای همه

                                                                                               دکتر صغری روحی

               

                                                                                                    درخت توگر بار دانش بگیرد

                                                                                                                                        به زیر آوری چرخ نیلوفری را                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                          ناصر خسرو

 

تصدیق (VERIFICATION) یا تایید (VALIDATION) ؟

هر آزمایشگاه دارای بخش ­های آزمایشگاهی متعددی است به همین دلیل

 هر بخش آزمایشگاهی باید طرح کیفیت خود را داشته باشد.

یکی از قسمت ­ها در طرح کیفیت هر بخش آزمایشگاه در کنار

اطمینان از عملکرد تجهیزات و

انجام امور مرتبط با  مصادیق کنترل کیفی حین انجام آزمایش و

تضمین کیفیت نتایج،

 توجه به تصدیق (VERIFICATION) یا تایید (VALIDATION)  روش ­های آزمایشی است

که برای آزمایش به کار گرفته می شوند.

 

در این میان  روش های اجرایی انجام آزمایشی وجود دارد که

در شرکت ­های آزمایشگاهی مورد صحه­ گذاری واقع شده و

به صورت کیت برای انجام آزمایش به آزمایشگاه های پزشکی معرفی شده و

بدون تغییر و تعدیل جهت کار در آزمایشگاه استفاده می شوند.

بررسی ویژگی های عملکردی این کیت ها در حد تصدیق(VERIFICATION)

 دربخش­ های آزمایشگاهی که اقدام به اندازه گیری های کمّی می نمایند

  اهمیت ویژه ای داشته،

 نیازمند برنامه ریزی  جهت تامین کیت به اندازه  کافی و

همکاری گسترده مسئول فنی، مدیر کیفیت، مسئول کنترل کیفی و کارشناسان آزمایشگاه­ هایی مانند

بخش های بیوشیمی، هورمون شناسی و ایمنی شناسی است.

لازم به ذکر است در این بخش ها است که اقدام به تعیین مقادیر کمّی آنالیت ها می شود.

 

بند ۵-۵-۱-۲ استاندارد INSO-ISO 15189  را در زیر مطالعه کنید

کاربران باید بدانند چه هدفی را دنبال می کنند.

جمله مهم انگیزشی:

عزیزان مطالعه کننده این مقاله، توجه داشته باشید

گام های صحه گذاری در حد تصدیق کیت های آزمایشگاهی کمی پرزحمت است

اما با انجام آن شکوفه های اطمینان خاطر نسبت به نتایج روش آزمایش در ذهن جوانه می زند.

 

روش اجرایی

صحه گذاری روش آزمایش یک فرایند است.

 لذا پس از کسب اطمینان از:

• ۱- مناسب بودن تجهیزات و کالیبره بودن آن ها و
• ۲- اطمینان از تسلط کافی اپراتور برای انجام آزمون و
• ۳-اطمینان از وجود کیت و معرف های آزمایشگاهی؛  تهیه شده از شرکت های آزمایشگاهی معتبر به میزان کافی و
• ۴-وجود دستورالعمل های معتبر آزمایش؛ بروشور کیت یا
• ۵-وجود دستورالعمل های معتبر آزمایش؛ متون درج شده در کتب معتبر و
• ۶-معیارهای مشخص پذیرش روش آزمایش،

 می توان جهت صحه گذاری روش آزمون در حد تصدیق اقدام نمود.

 

 برای این کار طبق

روش اجرایی مدون صحه گذاری روش آزمایش آزمایشگاه

  شاخص های زیر به ترتیب بررسی می گردد:

•  
• ۱-دقت روش(تکرار پذیری درون دور کاری و بین دورهای کاری)
• ۲-بررسی صحت روش آزمایش
• ۳-تعیین محدوده اندازه گیری روش Analytical Measuring Range (AMR) شامل بررسی خطی بودن و بررسی حد آشکارسازی و حد تشخیص؛ در واقع تعیین LOD و تعیین LOQ
• ۴-تخمین عدم قطعیت اندازه گیری های کمّی متاثر از ضریب انحراف و  بایاس برای بررسی درستی روش آزمایش
• ۵-تصدیق محدوده مرجع اعلام شده در بروشور کیت

 

 

بررسی شاخص اول:

دقت روش

(تکرار پذیری  و دقت درون آزمایشگاهی)

آزمایشگاه باید ادعای سازنده کیت در زمینه دقت روش را با آزمایش ۲۰ بار از یک نمونه

در دو یا سه سطح غلظتی؛ 

ترجیحا در سطوح تصمیم گیری بالینی،

به صورت بررسی دقت درون دور کاری و دقت بین دورهای کاری

 اثبات کند.

به این ترتیب که بعد از آزمایش، از خوانده ­ها میانگین گرفته، انحراف معیار خوانده ها را به دست آورده

با کمک این دو عدد درصد ضریب انحراف را محاسبه می نمایند.

تفسیر: این مقادیر باید از درصد ضریب انحراف ادعایی سازنده و

در بهترین حالت از ضریب انحراف مجاز ذکر شده در جداول بین المللی پایین تر باشد.

رفرانس این تصویر: کتاب خانم دکتر رضی

 

توجه:

انجام روش فوق برآورد دقت را امکان پذیر می کند.

بهتر است

برای انجام یک کار بهتر و دقیق تر یعنی

تصدیق دقت

از روش گفته شده در آخرین ویرایش سند

از سری اسناد منتشره توسط CLSI

یعنی

CLSI EP15-A3

استفاده شود.

یعنی انجام آزمایش با حداقل دو یا بیشتر نمونه بیمار یا

هر نمونه دیگر مشابه ماتریکس نمونه انسانی یا

نمونه سازگار با روش آزمایش

که تمامی بازه غلظت ادعایی سازنده را پوشش دهد

در ۵ روز کاری هریک روزانه ۵ تکرار و

بررسی آماری و

مقایسه تکرارپذیری  (Repeatability) و

دقت درون آزمایشگاهی (Wihin Lab Percision)

با مقادیر ادعایی کیت برای تصدیق دقت روش آزمایش

 

نکته مهم:

 روش فوق ساده و

در صورت استفاده از مواد دارای غلظت مشخص،

اجرای همزمان

تصدیق دقت  و برآورد عدم صحت

امکان پذیر می شود.  

 

هشدار؛

یک نکته مهم و قابل توجه:

فقط  و حتما اگر مرحله تکرارپذیری پاس شد

سراغ مرحله بعدی یعنی بررسی صحت روش آزمایش بروید.

 

بررسی شاخص دوم:

بررسی صحت روش آزمایش

برای بررسی صحت روش آزمایش از سه روش می توانید استفاده کنید:

1. آزمایش کنترل صحت
2. استفاده از روش بازیابی
3. استفاده از روش مقایسه روش ها

با توجه به این که صحت قابل اندازه گیری نیست

در آزمایشگاه به تعیین عدم صحت (بایاس یا نامیزانی) پرداخته می شود.

برای تعیین درصد بایاس یا نامیزانی،

قابل اعتمادترین روش “استفاده از کنترل صحت“ است

 اما با توجه به عدم دسترسی به کنترل صحت برای بسیاری از موارد آزمایش

 می توان  از یکی از

“روش های بازیابی“

 یا

“مقایسه روش ها“

استفاده کرد.

 

در این مقاله به توضیح “مقایسه روش ها“ پرداخته می شود.

در این روش، نتایج روش تحت آزمون

 با نتایج روش مناسب دیگری(ترجیحا مرجع) مقایسه می گردد.

برای این مقایسه باید ۴۰ نمونه در سه سطح غلظتی که گستره کاری را پوشش می دهند

آزمایش شوند.

برای به حداقل رساندن خطای سیستماتیک، آزمایش ترجیحا

در ۵ روز انجام شده و هر روز ۸ نمونه آزمایش می شود.

برای تفسیر نتایج اقدام به رسم Difference Plot و Comparison Plot نمایید.

توجه:

حداقل نمونه قابل قبول

به شرط رعایت قانون انتخاب سه سطح غلظتی که  گستره کاری را پوشش می دهند

۲۰ نمونه

است.

 

رفرانس این تصویر: کتاب خانم دکتر رضی

برای ادامه کار باید نسبت به تعیین فرمول خط نیز اقدام نمود.

 هر چقدر دو روش با هم سازگارتر باشند

شیب منحنی (Slope) و عدد رگرسیون  R² (ضریب تعیین) به عدد ۱ نزدیک تر خواهند بود.  

اگر عدد رگرسیون  R² (ضریب تعیین) کمتر از ۰٫۹۷۵  باشد

 یا باید تعداد نمونه بیشتری آزمایش شود و

یا باید از آزمون های آماری دیگر مانند paired T test

برای مقایسه نتایج استفاده شود.

توجه : عدد رگرسیون  r (ضریب همبستگی) بایستی بالاتر از ۰٫۹۹ باشد.

بررسی شاخص سوم:

تعیین محدوده اندازه گیری روش (AMR) شامل بررسی خطی بودن و

بررسی حد آشکارسازی و حد تشخیص؛ در واقع تعیین LOD و تعیین LOQ:

رفرانس این تصویر: کتاب خانم دکتر رضی

 

پس از سه بار آزمایش هر رقت از نمونه، از نتایج میانگین گرفته  و با  حاصل میانگین نتیجه برای هر رقت با کمک برنامه اکسل نسبت به رسم خط و به دست آوردن فرمول خط اقدام نمایید.

Y=bX+a

b: Slope

a: Intercept

رفرانس این تصویر: کتاب خانم دکتر رضی

 

 

توجه:

حداقل تعداد رقت قابل قبول

۴ تا ۵ رقت

است.

 

 

پس از سه بار آزمایش هر رقت از نمونه، از نتایج میانگین گرفته  و با  حاصل میانگین نتیجه برای هر رقت با کمک برنامه اکسل نسبت به رسم خط و به دست آوردن فرمول خط اقدام نمایید.

Y=bX+a

b: Slope

a: Intercept

 

اگر شرایط بالا حاکم باشد  یعنی slope  یا شیب منحنی بین ۰٫۹ تا ۱٫۱ و R² بالای ۰٫۹۷۵

و خطای کل پایین تر از خطای کل مجاز بود

نیاز به اقدام دیگری وجود نداشته

 روش آزمایش تا بالاترین سطح غلظتی مورد آزمایش خطی بوده،

بنابراین در زمان آزمایش تا این سطح غلظتی نیاز به رقیق کردن سرم بیماران وجود ندارد.

 به دست آوردن R مساوی یا بالاتر از ۰٫۹۹   بسیار ایده آل و حاکی از همبستگی نقاط است.

اگر شرایط ذکر شده در تصویر حاکم نبود یعنی slope کمتر از ۰٫۹  و یا R² کمتر از ۰٫۹۷۵  بود

 باید منطقه خطی بودن روش آزمایش با حذف غلظت های بالاتر و رسم مجدد خط تعیین شود.

 

برای تعیین LOD و LOQمی توانید از راهنمای یوروکم و یا سند CLSI EP17  و

فرمول های معرفی شده در آنها  استفاده کنید.

برای درک بهتر مطلب، مطالعه صفحات ۱۷۱ تا ۱۸۲ کتاب “مدیریت کیفیت در بیوشیمی”

تالیف آقای دکتر رضا محمدی استاد گرانقدر علم بیوشیمی

که به زبان ساده و سلیس موضوع را توضیح داده است، توصیه می گردد.

 در این کتاب آمده است که نقطه LOQ جایی است که

درصد ضریب انحراف حاصل از ۲۰ تکرار از آزمایش نمونه فاقد آنالیت

  با حدود اطمینان ۹۵%، معادل نصف خطای کل مجاز به شرط بایاس صفر باشد.

LOQ=(SD/(%TEa/2))*100

در ارزیابی روش­ ها، تعیین LOB  و LOD  برای آزمایش ­هایی مهم است

که وجود یا عدم وجود آنالیت اهمیت دارد.

تعیین LOQ برای آزمایش­ های مربوط به اندازه ­گیری قابل اعتماد مقادیر کم آنالیت ­هایی مانند هورمون­ ها  اهمیت دارد.

 

 

بررسی شاخص چهارم:

بررسی درستی روش آزمایش

 عدم قطعیت اندازه گیری های کمّی در آزمایشگاه تشخیص پزشکی

  متاثر از ضریب انحراف و  بایاس است.

:Reference of this picture

https://www.artel.co/learning_center/defining-accuracy-precision-and-trueness

 

   برای تخمین عدم قطعیت به استاندارد ISO-TS 20914 رجوع نمایید.

این استاندارد به تخمین عدم قطعیت در آزمایشگاه های پزشکی

با استفاده از رویکرد بالا به پایین

پرداخته است.

 

 

بررسی شاخص پنجم:

تصدیق محدوده مرجع اعلام شده در بروشور کیت

طبق مطلب ارائه شده در کتاب بیوشیمی Tietz 2018،

برای تصدیق دامنه مرجع در نظر گرفته شده در بروشور کیت، ابتدا ۲۰ نفر جمعیت طبیعی و سالم از نظر سن و جنس برای هر آزمایش را انتخاب کرده و سپس نمونه آنان را  با روش صحه­ گذاری شده در آزمایشگاه آزمایش نمایید.

• تفسیر: اگر برای هر آزمایش در هر گروه، مقادیر نتیجه آزمایش برای بیش از دو نفر خارج از دامنه پیشنهادی اعلام شده قرار گرفت، دامنه مرجع اعلام شده تصدیق نمی ­شود. در غیر این صورت دامنه مرجع اعلام شده تصدیق می­شود.

در صورت عدم تصدیق دامنه مرجع در مرحله اول، طبق توصیه کارشناسان باید این کار برای ۲۰ نفر دیگر انجام شود اگر مجددا نتیجه آزمایش برای بیش از دو نفر خارج از دامنه پیشنهادی اعلام شده برای روش آزمایش قرار گرفت، دامنه مرجع اعلام شده تصدیق نشده و باید برای روش مورد استفاده در آزمایشگاه محدوده مرجع جدید تعیین گردد.

 

به پایان آمد این دفتر حکایت همچنان باقی 

به صد دفتر نشاید گفت حسب الحال مشتاقی 

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           سعدی

برای تهیه طرح کیفیت آزمایشگاه و راه ­اندازی فرایند صحه گذاری ،

  به شکل اصولی و صحیح با ما تماس بکیرید.

همراهتان هستیم همراهمان باشید

www.yadazma.com

 

برای استقرار سیستم مدیریت کیفیت به شکل اصولی و صحیح در آزمایشگاهتان  با ما تماس بکیرید.

همراهتان هستیم همراهمان باشید.

 

با توجه به اهمیت موضوع مدیریت عدم انطباق بر اساس استاندارد ۱۵۱۸۹

در مطلب

 ” برای آزمایشگاهیان نوشته­ ام ۱۲“

 به موضوع

” مدیریت عدم انطباق، انجام اقدامات اصلاحی و پیشگیرانه”

پرداخته خواهد شد.

مطالعه این مطلب کاربردی به شما عزیزان آزمایشگاهی توصیه می­ شود.

 

سلسله مطالب “برای آزمایشگاهیان نوشته ­ام”

برای افزایش آگاهی و شروع بهبود در آزمایشگاه های پزشکی

 

این سلسله مطالب مفید را  

در سایت یادآزما

     دنبال کنید …

www.yadazma.com

 

 

برای دانلود فایل pdf مطلب بالا  اینجا  یا روی نوار آبی کلیک کنید.

نام فایل: برای آزمایشگاهیان نوشته ام ۱۱ (دکتر صغری روحی دهنبه)

پسوند فایل: pdf

لینک دانلود